正在液体培育基中对各代次肺炎球菌的培育时长进行对比；对第15代次（P15）取P4（对照组）进行菌种检定取荚膜多糖抗原基因序列阐发；将P15菌种按出产工艺进行发酵培育，阐发培育环境和荚膜多糖抗原产量及质量，取P4代次对比。成果正在P7—P15中，各代次培育时长附近，且P15菌种检定、抗原基因序列取P4比拟无差别，序列类似度为100%；P15菌种发酵培育后，菌体发展、荚膜多糖产量取荚膜多糖相关检定目标取P4无较着差别，且均合适中国药典质量尺度。肺炎球菌普遍分布于天然、人类鼻咽取动物粪便中，已判定出跨越100个血清型，少数可对人类致病，惹起脑膜炎、菌血症、肺炎等，导致免疫力低下人群灭亡。虽然抗生素医治肺炎球菌传染的结果优良，但抗生素的不合理利用导致肺炎球菌耐多药菌株不竭添加，使得防止显得尤为主要。当前有2类疫苗可用于防止肺炎球菌传染，即肺炎球菌多糖疫苗和肺炎球菌多糖连系疫苗。肺炎球菌多糖疫苗正在婴长儿、老年人和免疫缺陷者等人群中免疫应对低下。这种缺陷能够通过将多糖抗原取卵白载体缀合来降服。别的，还有一些肺炎球菌卵白以及灭活疫苗正处于上市申报或临床试验阶段。跟着肺炎球菌疫苗数量和品种的不竭添加，中国药品监管部分对疫苗产量和质量的把控越来越严酷。疫苗产量和质量的不变性由菌种和工艺不变性决定。据调研，目前尚无对肺炎球菌传代不变性的报道。本研究采用更接近发酵的液体培育基对肺炎球菌进行传代培育，对其生物学特征、荚膜多糖产量取疫苗多糖质量等方面进行阐发，从而确定肺炎球菌正在液体中的传代不变性。1。2。1试剂固体菌种培育基取液体发酵培育基次要成分：大豆卵白胨（25 kg/桶）购自法国Organotechnie公司，L-半胱氨酸盐酸盐（5 kg/袋，药用级）购自天津天药药业股份无限公司，L-色氨酸（100 g/瓶，生化试剂）购自国药集团化学试剂无限公司，L-酪氨酸（25 kg/桶， 药用级）购自天津天药药业股份无限公司，磷酸氢二钾（1 kg/袋，药用级）购自湖南九典宏阳制药无限公司，浓盐酸（500 ml/瓶，药用级）购自湖南尔康制药股份无限公司。葡萄糖发酵管、菊糖发酵管、棉子发酵管、蜜二糖生化管、山梨醇发酵管购自青岛海博生物手艺无限公司，奥普托欣纸片购自温州市康泰生物科技无限公司。311二氧化碳培育箱、SORVAIL LYNX6000高速离心计心情购自赛默飞世尔科技（中国）无限公司，SP-752紫外分光光度计购自普希科技无限公司，VS-1300L-U干净工做台购自姑苏安泰空气手艺无限公司，BLBIO-5GJ-4-H四联机械搅拌玻璃发酵罐购自上海百仑生物科技无限公司，JMCDSPCONS超滤系统购自Merk Millipore公司。将肺炎球菌工做种子第4代（P4）接种于固体菌种培育基上，为P5，培育一段时间后接种于液体发酵培育基中，为P6，此后正在液体发酵培育基中持续传代培育至P15。菌浓度以694 nm处吸光度值（A694 nm）暗示，P6—P15均正在液体发酵培育基中培育至A694 nm达0。4~0。6时，对培育时长进行统计。向P15菌液中插手体积分数30%的甘油，-70 ℃保留。对P15菌种取P4菌种（对照）进行菌种检定，检定项目包罗培育特征、染色镜检、生化反映、胆汁溶菌试验、奥普托欣试验、荚膜肿缩试验。10 000×g离心收集P15菌体，委托诺禾致源科技股份无限公司操纵Oxford Nanopore测序手艺进行第3代全基因组测序。利用DNAMAN软件对P15菌种取P4菌种（对照）的荚膜多糖合成相关的基因序列进行对比。1。7。1发酵研究将24个血清型肺炎球菌按照进化关系和荚膜多糖合成机制分为5类，别离拔取代表性的3、5、9N、19F和33F型肺炎球菌为试验对象。别离肺炎球菌P15菌种取P4菌种（对照），经1代苏醒后，别离转种于150 ml液体培育基中进行2代培育，A694 nm达0。4~0。6后别离转种至2。5 L发酵罐进行分批补料发酵培育。1。7。2多糖纯化发酵培育竣事后，插手0。1%脱氧胆酸钠杀菌；15 000×g离心去菌体，上清液经超滤后进行酸沉（向超滤浓缩液中插手冰醋酸调pH至4。00±0。20，静置1~3 h）、醇沉（料液中插手无水乙醇静置3~24 h），再经10倍1 mmol/L醋酸钠缓冲液对离心后的上清液洗滤后获得精制多糖原液。按照中国药典2020年版三部（药典三部）公例3429免疫化速度散射比浊法测定多糖含量。别离对P15取P4（对照）菌种发酵液纯化后的多糖原液进行检测，参照药典三部相关方式，对多糖原液进行检测，包罗固体总量、卵白质含量（Lowry法）、核酸含量（分光光度法）、总氮（凯氏定氮法）、总磷（钼酸铵法）、大小〔琼脂糖凝胶（SepharoseCL-4B/SepharoseCL-2B）过滤法〕、氨基己糖（二氨基苯甲醛显色法）、甲基戊糖（半胱氨酸显色法）。P6—P15各代菌种正在液体发酵培育基中培育至不异的菌浓度（A694 nm达0。4~0。6），培育时长见图1。P6菌种由固体培育转为液体培育，其发展发生了猛烈变化，因而部门P6菌种发展的时长大于其他代次。P7—P15各代次培育时长附近，正在传代过程较不变。各血清型P15菌种检定成果均及格：培育特征试验成果均合适；染色镜检均为革兰阳性球菌；生化反映葡萄糖、棉子糖、蜜二糖均为阳性，山梨醇为阳性；胆汁溶菌试验菌液均变通明；奥普托欣试验除33F血清型对照试验抑菌圈曲径为16 mm外，其余试纸抑菌圈曲径均为15 mm；荚膜肿缩试验菌体四周均可见较着无色荚膜。成果表白正在液体中传代对肺炎球菌无影响。荚膜多糖相关基因位点位于dexB和aliA之间，环节序列长约20 000 bp。对各血清型P15、P4 菌种的荚膜多糖相关基因序列进行对比，类似度均为100%。表白肺炎球菌正在液体培育基中传代不变。别离将P15、P4（对照）菌种苏醒后，用不异的发酵培育基取发酵前提进行发酵，并察看取对比统一血清型的2条发酵发展曲线F型肺炎球菌正在发酵的迟缓期、对数发展期和不变前期均无较着差别。当发酵进入对数后期或不变前期时进行收成，收成时间点如图中标示的点所示。P15菌种收成时菌浓度取对照无较着差别。别离对P15取P4（对照）的发酵液进行多糖含量检测，并对其发酵的多糖表达量进行计较，见表2。3、5、9N、17F、33F型P15菌种发酵表达量取P4（对照）无较着差别。由表3可知，3、5、9N、17F、33F型P15取P4（对照）的多糖原液各项目标无较着差别，且均合适药典三部23价肺炎球菌多糖疫苗尺度。将24个血清型肺炎球菌按照进化关系和荚膜多糖合成机制分为5类。第1类包罗1、2、6A、6B、7F、17F、18C、19A、19F、22F和23F；第2类包罗8、9N、9V、11A、14和15B；第3类包罗10A、20和33F；第4类包罗4、5和12F；第5类包罗3型。本研究别离拔取代表性的3、5、9N、19F和33F型肺炎球菌为试验研究对象。肺炎球菌传代培育时，P6菌种由固体培育转为液体培育，其发展发生了猛烈变化，且因为分歧血清型顺应能力分歧，因而部门P6菌种发展的时长大于其他代次。分歧血清型正在P7—P15各个代次中，培育至不异菌浓度（A694 nm正在0。4~0。6）时，其培育时长正在传代过程中都较为不变。正在检测方面，按照药典三部公例的形态及培育特征、生化反映、胆汁溶菌试验、奥普托欣试验、血清凝固试验及遗传不变性研究等方式，别离对P15取P4（对照）菌种进行检定。药典三部中从种子批启开后至工做种子批，传代应不跨越5代；工做种子批启开后至接种发酵罐培育，传代应不跨越5代。通过上述尝试和检测成果，能够得出结论：各血清型肺炎球菌菌种正在生物学特征、生化特征、血清凝固试验和遗传特征等方面均合适23价肺炎球菌多糖疫苗各论要求，从而了肺炎球菌正在利用代次内传代过程中可以或许不变遗传。正在遗传不变性方面，对肺炎球菌1个代次菌种经培育收成的菌体进行了全基因组测序，类似度均为100%。利用3代测序手艺对肺炎球菌荚膜多糖环节基因片段进行检测，P4取P15测序中暂未发觉序列突变，通过比力分歧传代程度菌种基因组的核苷酸序列确定了种子批的遗传不变性。通过对基因组的测序成果阐发能够正在后续的出产和利用过程中更好地保留、办理、监测菌种。通过节制单一变量的方式，别离将P15取P4代次苏醒后的3、5、9N、17F、33F型菌种进行发酵培育，统一血清型发酵发展曲线的迟缓期、对数发展期和不变期均无较着差别，且P15取P4菌种的发酵表达量无较着差别，均正在800 μg/ml以上，从而了肺炎球菌正在利用代次内的传代过程中具有优良的遗传不变性。本研究通过度析肺炎球菌菌种、发酵培育阶段生物学特征、遗传不变性和纯化阶段产量分歧性，确定了肺炎球菌多糖疫苗出产用菌种分歧批次培育后菌种传代不变性，从而出产过程中菌种不变性及产物产量和质量的不变性。综上所述，肺炎球菌菌种成立的从种子批、工做种子批均合适中国药典要求，具有优良的细菌培育传代不变性。这一研究为肺炎球菌疫苗的出产研究和质量节制奠基了优良的研究根本，同时也为进一步研究肺炎球菌的基因遗传和表不雅遗传不变性供给了无力的根据。后续将做好出产研发菌种的传代试验以疫苗质量合适规程要求，添加多批次发酵的数据并进行阐发，从而使研究成果和会商有据可依，为肺炎球菌多糖连系疫苗菌株遗传不变性相关研究奠基优良理论根据。援用本文：陈淑霞， 王研研， 汪辉， 等。肺炎球菌多糖连系疫苗菌株传代不变性研究[J]。 国际生物成品学， 2024， 47(6)！ 349-354！